A comprehensive overview of miRNA targeting drought stress resistance in plants / Uma visão geral abrangente do miRNA visando a resistência ao estresse hídrico em plantas

MicroRNAs (miRNAs) are essential nonprotein-coding genes. In a range of organisms, miRNAs has been reported to play an essential role in regulating gene expressions at post-transcriptional level. They participate in most of the stress responsive processes in plants. Drought is an ultimate abiotic stress that affects the crop production. Therefore understanding drought stress responses are essential to improve the production of agricultural crops. Throughout evolution, plants have developed their own defense systems to cope with the adversities of environmental stresses. Among defensive mechanisms include the regulations of gene expression by miRNAs. Drought stress regulates the expression of some of the functionally conserved miRNAs in different plants. The given properties of miRNAs provide an insight to genetic alterations and enhancing drought resistance in cereal crops. The current review gives a summary to regulatory mechanisms in plants as well as miRNAs response to drought stresses in cereal crops. Some possible approaches and guidelines for the exploitation of drought stress miRNA responses to improve cereal crops are also described.

MicroRNAs (miRNAs) são genes essenciais não codificadores de proteínas. Em uma variedade de organismos, foi relatado que miRNAs desempenham papel essencial na regulação da expressão gênica em nível pós-transcricional. Eles participam da maioria dos processos responsivos ao estresse nas plantas. A seca é um estresse abiótico final que afeta a produção agrícola. Portanto, compreender as respostas ao estresse da seca é essencial para melhorar a produção de safras agrícolas. Ao longo da evolução, as plantas desenvolveram seus próprios sistemas de defesa para lidar com as adversidades do estresse ambiental. Entre os mecanismos de defesa está a regulação da expressão gênica por miRNAs. O estresse hídrico regula a expressão de alguns dos miRNAs funcionalmente conservados em diferentes plantas. As propriedades dadas dos miRNAs fornecem uma visão das alterações genéticas e aumentam a resistência à seca nas safras de cereais. A revisão atual apresenta um resumo dos mecanismos regulatórios nas plantas, bem como a resposta dos miRNAs ao estresse hídrico nas plantações de cereais. Algumas abordagens e diretrizes possíveis para a exploração das respostas do miRNA ao estresse da seca para melhorar as safras de cereais também são descritas.

A comprehensive overview of miRNA targeting drought stress resistance in plants

Abstract MicroRNAs (miRNAs) are essential nonprotein-coding genes. In a range of organisms, miRNAs has been reported to play an essential role in regulating gene expressions at post-transcriptional level. They participate in most of the stress responsive processes in plants. Drought is an ultimate abiotic stress that affects the crop production. Therefore understanding drought stress responses are essential to improve the production of agricultural crops. Throughout evolution, plants have developed their own defense systems to cope with the adversities of environmental stresses. Among defensive mechanisms include the regulations of gene expression by miRNAs. Drought stress regulates the expression of some of the functionally conserved miRNAs in different plants. The given properties of miRNAs provide an insight to genetic alterations and enhancing drought resistance in cereal crops. The current review gives a summary to regulatory mechanisms in plants as well as miRNAs response to drought stresses in cereal crops. Some possible approaches and guidelines for the exploitation of drought stress miRNA responses to improve cereal crops are also described.

Resumo MicroRNAs (miRNAs) são genes essenciais não codificadores de proteínas. Em uma variedade de organismos, foi relatado que miRNAs desempenham papel essencial na regulação da expressão gênica em nível pós-transcricional. Eles participam da maioria dos processos responsivos ao estresse nas plantas. A seca é um estresse abiótico final que afeta a produção agrícola. Portanto, compreender as respostas ao estresse da seca é essencial para melhorar a produção de safras agrícolas. Ao longo da evolução, as plantas desenvolveram seus próprios sistemas de defesa para lidar com as adversidades do estresse ambiental. Entre os mecanismos de defesa está a regulação da expressão gênica por miRNAs. O estresse hídrico regula a expressão de alguns dos miRNAs funcionalmente conservados em diferentes plantas. As propriedades dadas dos miRNAs fornecem uma visão das alterações genéticas e aumentam a resistência à seca nas safras de cereais. A revisão atual apresenta um resumo dos mecanismos regulatórios nas plantas, bem como a resposta dos miRNAs ao estresse hídrico nas plantações de cereais. Algumas abordagens e diretrizes possíveis para a exploração das respostas do miRNA ao estresse da seca para melhorar as safras de cereais também são descritas.

A comprehensive overview of miRNA targeting drought stress resistance in plants / Uma visão geral abrangente do miRNA visando a resistência ao estresse hídrico em plantas

Abstract MicroRNAs (miRNAs) are essential nonprotein-coding genes. In a range of organisms, miRNAs has been reported to play an essential role in regulating gene expressions at post-transcriptional level. They participate in most of the stress responsive processes in plants. Drought is an ultimate abiotic stress that affects the crop production. Therefore understanding drought stress responses are essential to improve the production of agricultural crops. Throughout evolution, plants have developed their own defense systems to cope with the adversities of environmental stresses. Among defensive mechanisms include the regulations of gene expression by miRNAs. Drought stress regulates the expression of some of the functionally conserved miRNAs in different plants. The given properties of miRNAs provide an insight to genetic alterations and enhancing drought resistance in cereal crops. The current review gives a summary to regulatory mechanisms in plants as well as miRNAs response to drought stresses in cereal crops. Some possible approaches and guidelines for the exploitation of drought stress miRNA responses to improve cereal crops are also described.

Resumo MicroRNAs (miRNAs) são genes essenciais não codificadores de proteínas. Em uma variedade de organismos, foi relatado que miRNAs desempenham papel essencial na regulação da expressão gênica em nível pós-transcricional. Eles participam da maioria dos processos responsivos ao estresse nas plantas. A seca é um estresse abiótico final que afeta a produção agrícola. Portanto, compreender as respostas ao estresse da seca é essencial para melhorar a produção de safras agrícolas. Ao longo da evolução, as plantas desenvolveram seus próprios sistemas de defesa para lidar com as adversidades do estresse ambiental. Entre os mecanismos de defesa está a regulação da expressão gênica por miRNAs. O estresse hídrico regula a expressão de alguns dos miRNAs funcionalmente conservados em diferentes plantas. As propriedades dadas dos miRNAs fornecem uma visão das alterações genéticas e aumentam a resistência à seca nas safras de cereais. A revisão atual apresenta um resumo dos mecanismos regulatórios nas plantas, bem como a resposta dos miRNAs ao estresse hídrico nas plantações de cereais. Algumas abordagens e diretrizes possíveis para a exploração das respostas do miRNA ao estresse da seca para melhorar as safras de cereais também são descritas.

Micro-RNAs differentially expressed in comparative analysis of sperm samples with high and low efficiency in the in vitro production of bovine (Bos Taurus) embryos / Micro-rnas diferencialmente expressos em análise comparativa de amostras de espermatozoides com alta e baixa efi ciência na produção in vitro de embriões bovinos (bos taurus )

Infertility or subfertility in bovine males may be related to spermatic microRNAs (miRNAs), whose function seems to be associated with the regulation of gene expression, degradation orstorage of messenger RNAs (mRNAs) for later translation into early embryonic development. Thus, the purpose of this study was to identify differentially expressed miRNAs in semen samples from bulls (Bos taurus) with low and high efficiency in the in vitro embryo production (IVEP) and to evaluate if they can be used as markers of semen efficiency for IVEPs. In order to identify miRNA markers of semen efficiency in thein vitro embryo production, eight semen samples from each animal, one bull with high and two bulls with low efficiency in IVEPs were used to perform the RNAseq technique for miRNAs. Initially the samples were washed with PBS to remove the extender semen and subsequently were submitted to RNA extraction protocols performed according to procedures described by mirVana™ miRNA Isolation Kit. Then, the amplification of the miRNAs was carried out, not to mention the preparation of the library (Ion Total RNA-Seq Kit v2), the PCR emulsion reaction, enrichment, as well as the injection of the sample on the chip by the Ion Chef equipment. The sequencing was done on Ion Proton equipment. The comparison between the samples was established using two methodologies for searching for targets to increase the robustness of the analytical procedure: the miRanda program using as cutoff minimum free energy of the hybridization -20 kcal/Mol, 100% of identity between nucleotides 2 and 8 of the miRNA, and the RNAhybrid program, using as cutoff minimum free energy of hybridization -20 kcal/mol. In sum, 1306 miRNAs were identified in the samples. The bta-miR-380-5p, bta-miR-155, bta-miR-30c and bta-miR-34a genes were identified by the Bioinformatics as being strongly differentially expressed between the groups, indicating that these genes may present themselves as possible efficiency markers. However, it has become clear that there is no single miRNA that marks different types and causes of fertility problems.

A infertilidade ou subfertilidade em machos bovinos pode estar relacionada a microRNAs espermáticos (miRNAs), cuja função parece estar associada à regulação da expressão gênica, degradação ou armazenamento de RNAs mensageiros (mRNAs), para posterior tradução no desenvolvimento embrionário inicial. Assim, o objetivo deste estudo foi identificar miRNAs diferencialmente expressos em amostras de sêmen de touros (Bos taurus) com baixa e alta eficiência na produção in vitro de embriões (PIVE) e avaliar se eles podem ser utilizados como marcadores de eficiência do sêmen em PIVEs. Para identificar miRNA marcadores da eficiência de sêmen em PIVE, oito amostras de sêmen de cada animal, sendo um touro com alto e dois touros com baixa eficiência, foram utilizados para realizar a técnica de RNAseq para miRNAs. Inicialmente as amostras foram lavadas com PBS para remover o diluente do sêmen e, posteriormente, foram submetidas a protocolos de extração de RNA realizados de acordo com os procedimentos descritos pelo Kit de isolamento de miRNA mirVana ™. Em seguida, foi realizada a amplificação dos miRNAs, a preparação da biblioteca (Ion RNA-Seq Kit v2), a reação de emulsão de PCR, enriquecimento e a injeção das amostras no chip apropriado utilizando o equipamento Ion. Chef. O sequenciamento foi realizado no equipamento Ion Proton. A comparação entre as amostras foi estabelecida utilizando duas metodologias de busca de alvos para aumentar a robustez do procedimento analítico: o programa miRanda utilizando como valor de corte a energia mínima livre de hibridização -20 kcal / Mol e 100% de identidade entre os nucleotídeos 2 e 8 do miRNA, e o programa RNAhybrid, utilizando como valor de corte a energia mínima livre de hibridização -20 kcal / mol. Em suma, 1306 miRNAs foram identificados nas amostras. Os genes bta-miR-380-5p, bta-miR-155, bta-miR-30c e bta-miR-34a foram identificados pela bioinformática como sendo fortemente diferencialmente expressos entre os grupos, indicando que esses genes podem se apresentar como possíveis marcadores de eficiência. No entanto, ficou claro que não existe um único miRNA que marque diferentes tipos e causas de problemas de fertilidade.

Regulação da expressão de pioverdina dependente de contato em pseudomonas aeruginosa / Regulation of surface-dependent pyoverdine expression in Pseudomonas aeruginosa

A gama-proteobactéria Pseudomonas aeruginosa é um patógeno oportunista humano frequentemente associado a pacientes com queimadura grave e aos portadores de fibrose cística. O estabelecimento de infecção depende de uma série de fatores que contribuem para a virulência deste patógeno, dentre eles a produção de sideróforos e outros sistemas de captação de ferro. Pioverdina é o principal sideróforo sintetizado por bactérias do gênero Pseudomonas e linhagens deficientes na sua produção são incapazes de estabelecer infecção em modelos animais. A regulação da biossíntese deste sideróforo envolve a agregação entre as células, indicando a dependência de contato para completa indução da sua produção. O contato com uma superfície altera o comportamento das células e diversos fenótipos são dependentes deste sinal mecânico. PrlC é uma oligopeptidase A putativamente envolvida na degradação de peptídeo-sinais e PA14_00800, uma pequena proteína com domínio de função desconhecida, codificada por um gene imediatamente à jusante de prlC. Existem poucos trabalhos na literatura sobre PrlC e seus homólogos e nenhuma informação sobre PA14_00800. Este trabalho teve como objetivo elucidar o envolvimento de PrlC e PA14_00800 na regulação da produção de pioverdina por células em contato com uma superfície. Para estabelecer uma correlação na expressão destes genes, um estudo da organização gênica foi realizado por RT-PCR, confirmando que eles fazem parte do mesmo operon e, portanto, que a expressão destes genes é regulada pelos mesmos fatores. Ensaios classicamente modulados pelo segundo mensageiro c-di-GMP, como formação de biofilme e motilidade, não apresentaram variações nas linhagens mutantes ΔprlC, ΔPA14_00800 ou Δoperon, indicando que a deleção destes genes não altera significativamente os níveis de c-di-GMP nas células. A motilidade do tipo swarming é, no entanto, severamente afetada na linhagem ΔPA14_00800 quando o meio de cultura não contém cloreto de cálcio e glicose, indicando um defeito na sinalização celular ou requerimento energértico desta linhagem nestas condições. PA14_00800 regula a fluorescência de P. aeruginosa em meio sólido e semissólido, mas não em meio líquido. Esta fluorescência depende tanto de pioverdina quanto de PQS, umamolécula de comunicação celular fluorescente, e a possibilidade de outros fatores estarem envolvidos neste fenótipo ainda está sob investigação. Análise do transcritoma por RNASeq com a linhagem ΔPA14_00800 comparada à linhagem parental foi realizada a partir de colônias destas linhagens crescidas em M9 modificado. Genes envolvidos no sistema de secreção do tipo III e do tipo VI e na biossíntese de PQS apareceram dentre os genes diferencialmente expressos, bem como genes para o catabolismo de glicose. Este trabalho foi o primeiro a investigar o papel de PA14_00800 na fisiologia de P. aeruginosa, e os conhecimentos adquiridos aqui podem ser transpostos, com cautela, para compreensão da função dos homólogos de PA14_00800 em outras bactérias

The gamma-proteobacterium Pseudomonas aeruginosa is a human opportunistic pathogen frequently associated with patients with severe burns and those with cystic fibrosis. The establishment of infection depends on several factors that contribute to the virulence of this pathogen, among them siderophore production and other iron uptake systems. Pyoverdine is the main siderophore synthesized by the bacteria of the genus Pseudômonas and pyoverdinedeficient strains are unable to establish infection in animal models. The regulation of biosynthesis of this siderophore involves cell aggregation, indicating contact dependency for complete induction of pyoverdine production. Surface contact alters cell behavior and several phenotypes are dependent on this mechanical cue. PrlC is an oligopeptidase A putatively involved in peptide-signals degradation and PA14_00800, a small protein with a domain of unknown function, encoded by a gene immediately downstream of prlC. There are few papers in the literature on PrlC and its homologues and no information on PA14_00800. This work aimed to elucidate the role of PrlC and PA14_00800 in surface-dependent regulation of pyoverdine production. To establish a correlation in the expression of these genes, a study of the gene organization was performed by RT-PCR, confirming that they are part of an operon and therefore the expression of these genes is regulated by the same factors. Traits classically modulated by the second messenger c-di-GMP, such as biofilm formation and motility, did not show variations in the ΔprlC, ΔPA14_00800 or Δoperon, indicating that the deletion of these genes does not significantly alter the levels of c-di-GMP within the cells. Swarming motility is, however, severely affected in the strain ΔPA14_00800 when the culture medium does not contain calcium chloride and glucose, indicating a cell signaling defect or energetic requirement under these conditions. PA14_00800 regulates surface-dependent fluorescence of P. aeruginosa, in solid and semi-solid medium. This fluorescence depends on both pyoverdine and PQS, a fluorescent cell-to-cell communication molecule, and the investigation of other putative factors involved in this phenotype is still under study. Transcriptomic analysis by RNASeq with the strain ΔPA14_00800 compared to PA14 was performed from colonies ofthese strains grown in modified M9 1% agar. Genes involved in the type III and type VI secretion systems, in PQS biosynthesis and glucose catabolism were differentially expressed. This work was the first to investigate the role of PA14_00800 in the physiology of P. aeruginosa, and the knowledge obtained here can be cautiously transposed to understanding the role of PA14_00800 homologues in other bactéria

Um novo gene de Pseudomonas aeruginosa envolvido em percepção de quórum / A novel gene involved in Pseudomonas aeruginosa quorum sensing

Pseudomonas aeruginosa é uma gamaproteobactéria com capacidade de colonizar diversos tipos de ambiente e infectar hospedeiros filogeneticamente distintos. Em humanos, comporta-se como um patógeno oportunista,estando frequentemente relacionada à infecções em indivíduos imunocomprometidos e indivíduos portadores de fibrose cística. Um mecanismo importante para a versatilidade de P. aeruginosa é o sistema de percepção de quórum (QS), onde a bactéria pode vincular expressão gênica à densidade populacional e às características do ambiente. Atualmente, sabe-se que muitos outros reguladores estão interligados com QS, entre eles, a proteína reguladora RsmA e os pequenos RNAs RsmZ e RsmY. Além disso, diversos fatores importantes para a patogenicidade da bactéria são reguladas por QS. Em P. aeruginosa PA14, um fator importante para a patogenicidade em diversos hospedeiros é a proteína KerV, cujo envolvimento com QS foi descrito pela primeira vez neste trabalho. A linhagem D12, que possui uma deleção no gene kerV, mostrou alterações em fenótipos regulados por QS, como a maior produção de piocianina, composto que contribui para virulência e persistência das infecções causada por P. aeruginosa. Por ser facilmente detectável e pela regulação de sua síntese não ter sido completamente explorada em PA14, a expressão dos genes responsáveis pela produção de piocianina é um interessante repórter na investigação do possível envolvimento de KerV com QS. Além de piocianina, D12 apresenta níveis reduzidos de ramnolipídeos. Esses fenótipos somados se assemelham aos fenótipos da mutação de rsmA, sugerindo o envolvimento de KerV com os sistemas QS e Gac-Rsm direta ou indiretamente. Neste trabalho, mostramos que KerV exerce um efeito negativo na regulação dos operons phz1 e phz2, responsáveis pela síntese de piocianina, alterando a expressão desses genes. KerV exerce também um efeito positivo na expressão da proteína RsmA, responsável pela repressão de diversos genes alvos, onde RsmA se liga ao sítio de ligação ao ribossomo no mRNA, impedindo a tradução. Ensaios de gel shift mostraram que a ligação direta de RsmA na sequência líder de phzA1 e phzA2 ocorre, elucidando a maneira pela qual KerV está envolvido na regulação da expressão dos operons phz em P. aeruginosa PA14. Mostramos também que phz2 é ativo e contribui para a síntese de piocianina, pois na ausência de phz1, os níveis do pigmento são maiores do que aqueles detectados em PA14. Isso sugere uma maior expressão de phz2 e uma regulação diferencial dos operons de acordo com as condições ambientais como possível estratégia para manter os níveis desse composto. Uma evidência dessa regulação diferencial é vista no mutante lasR. Na fase inicial de crescimento, esse mutante não produz piocianina, porém quando exposto a tempos mais longos de cultivo, a produção de piocianina é maior quando comparada a PA14. Isso é reflexo da ativação da expressão de phz1 no mutante lasR em fase estacionária tardia, enquanto phz2 permanece não expresso. Isso indica que phz2 é dependente de LasR, ainda que indiretamente. Já phz1, embora tenha sua expressão influenciada por LasR no estágio inicial de crescimento, na fase estacionária é regulado por outros fatores independentes de las

Pseudomonas aeruginosa is a gammaproteobacterium that colonizes several environments and infects phylogenetically distinct hosts. It behaves as an opportunistic pathogen in humans, often related to infection in immunocompromised individuals and cystic fibrosis patients. An important mechanism for P. aeruginosa versatility is the quorum sensing (QS) network, that allows bacteria to link gene expression to population density and environmental traits. Several additional regulators are interconnected with QS, as the regulatory mRNA binding protein RsmA and the non-coding small RNAs RsmZ and RsmY. Futhermore, key factors for pathogenicity are QS-regulated. In P. aeruginosa PA14, an important pathogenicity-related factor is the KerV protein, described for the first time here as involved in QS. D12 strain, that harbor a deletion in the kerV gene, shows alterations in QS-regulated phenotypes, such as high production of pyocyanin, a compound that contributes to virulence and persistence of P. aeruginosa infections. As the production of pyocyanin is easily detected and all mechanisms involved in its synthesis regulation are not fully described, the expression of genes responsible for production of this pigment is a good reporter to investigate KerV involvement in the QS network. Additionally, D12 also shows lower levels of rhamnolipids, another QS-regulated trait. Taken together, these phenotypes resemble the effects of a rsmA mutation, suggesting KerV involvement with QS and Gac-Rsm systems. In this work, we propose that KerV exerts a negative effect in the regulation of phz1 and phz2 operons, responsible for pyocyanin synthesis, by alterating the expression of these genes. KerV also has a positive effect on rsmA expression, responsible for the repression of several genes by blocking the ribosome binding site preventing the translation. Gel shift assays showed that RsmA binds directly in the leader sequence of phzA1 and phzA2, elucidating the manner in which KerV is involved in the regulation of phz operons expression in P. aeruginosa PA14. We also demonstrate that phz2 is actively expressed and contributes to pyocyanin production in PA14, since in the phz1 mutant the levels of pyocyanin are even higher than in the wild type strain. This suggests a phz2 higher expression and a differential regulation of phz operons according to environmental changes as a mechanism to maintain the levels of pyocyanin synthesis. An evidence for this regulation is the synthesis of pyocyanin by the lasR mutant, which does not make pyocyanin at early growth stages. However, at late stationary phase, pyocyanin production is even higher than in the wild-type strain, reflecting the LasR-independent regulation of phz1 expression, while phz2 operon remains silent

Estudo da função do gene kerV de Pseudomonas aeruginosa / Function of Pseudomonas aeruginosa kerV gene

P. aeruginosa PA14 é uma linhagem isolada de queimadura que apresenta vários fatores de patogenicidade comuns no quadro de infecção de hospedeiros filogeneticamente distintos (plantas, mamíferos ou invertebrados). O gene kerV foi revelado numa busca por mutantes atenuados em virulência em uma biblioteca de mutantes por transposons da linhagem PA14 (Rahme et al., 1997). A caracterização da linhagem D12, mutante em kerV, confirmou sua virulência atenuada (Apidianakis et al., 2005 e An et al., 2009) e resultados do transcriptoma mostraram alteração na expressão de mais de 500 genes, sendo alguns relacionados com o sistema de "quorum sensing" (Rahme et al, dados não publicados). O gene kerV está próximo à montante ao gene gloB, envolvido em detoxificação de metilglioxal, e à jusante aos genes rnhA e dnaQ, que codificam proteínas envolvidas na replicação e reparo do DNA. Este trabalho teve como objetivo estudar a função molecular do produto de kerV e a expressão dos genes do lócus kerV-rnhA-dnaQ. Análises de bioinformática indicam que a proteína KerV é uma metiltransferase dependente de S-adenosil-metionina (SAM), apresentando um domínio conservado de ligação a SAM e uma arquitetura de domínio compatível com a organização em fitas-beta e hélices-alfa alternadas descritas para a família das metiltransferases dependentes de SAM. Ela não apresenta outros domínios conservados que indiquem seu substrato de metilação. A expressão heteróloga desta proteína em E. coli, mostrou que ela é expressa de maneira parcialmente solúvel quando co-expressa com as chaperoninas GroEL/GroES em baixas temperaturas ou quando fusionada a MBP ou GST. A purificação desta proteína mostra que ela é co-eluída com a chaperonina GroEL sugerindo que para atingir sua conformação nativa ela necessita dessas proteínas acessórias. MBP-KerV purificado foi usado para ensaios "in vitro" de atividade de metiltransferase e ligação a SAM, que não foram conclusivos, pois não há certeza do seu ...

P. aeruginosa PA14 is a burn isolate multi-host pathogen strain. The screening for virulence attenuated mutants in a PA14 transposon mutant library revealed the kerV gene (Rahme et al., 1997). The characterization of D12 strain, a kerV mutant, confirmed the attenuated virulence phenotype (Apidianakis et al., 2005 and An et al., 2009) and transcriptome analysis showed the expression of more than 500 genes are affected in D12, some of these genes are related with quorum sensing (Rahme et al, unpublished data). kerV is upstream of the gloB gene, related with methylglioxal detoxification and downstream of the rnhA and dnaQ genes, both related with DNA replication and repair. The purpose of this work was to study the molecular function of KerV product and the expression of kerV-rnhA-dnaQ locus. Bioinformatics analysis indicated that KerV is a SAM dependent methyltransferase that have a conserved SAM binding domain with architecture compatible with classic alternating β-stranded and α-helical regions. KerV does not show any other conserved motif that could indicate its methylation substrate. Heterologous expression in E. coli showed that KerV is partially soluble only when co-expressed with GroeL/GroES chaperones at low temperatures or when KerV is in fusion with MBP or GST tag. During the purification process KerV was copurified with GroEL chaperone suggesting that this association may be required for the correct folding of KerV. Methyltransferase activity and SAM binding assays were done with purified MBPKerV and the results were not conclusive since the proper conformation of MBP-KerV cannot be verified. Yeast two-hybrid assays indicated that RNaseH and DnaQ are not interaction partners of KerV, suggesting that their functions are not directly related. The mutation frequency of D12 strain increased only about four times in relation to PA14, suggesting that KerV is not directly involved with DNA mismatch repair. The assays to detect methylation...

The central role of RNA in the genetic programming of complex organisms

Notwithstanding lineage-specific variations, the number and type of protein-coding genes remain relatively static across the animal kingdom. By contrast there has been a massive expansion in the extent of genomic non-proteincoding sequences with increasing developmental complexity. These non-coding sequences are, in fact, transcribed in a regulated manner to produce large numbers of large and small non-protein-coding RNAs that control gene expression at many levels including chromatin architecture, post-transcriptional processing and translation. Moreover, many RNAs are edited, especially in the nervous system, which may be the basis of epigenome-environment interactions and the function of the brain.

Apesar das variações linhagem-específicas, o número e tipo de genes codificadores de proteínas permanecem relativamente estáticos no reino animal. Em contraste, houve uma expansão maciça da quantidade de sequências genômicas não-codificadoras de proteínas com o aumento da complexidade do desenvolvimento. Essas sequências não codificadoras são, de fato, transcritas de maneira regulada para produzirem numerosos RNAs grandes e pequenos não-codificadores de proteínas que controlam a expressão de genes em vários níveis, incluindo a arquitetura da cromatina, o processamento pós-transcricional e a tradução. Além disso, muitos RNAs são editados, especialmente no sistema nervoso, o que pode ser a base de interações epigenoma-ambiente e a função do cérebro.

Enhancing T3 and cAMP responsive gene participation in the thermogenic regulation of fuel oxidation pathways / Ampliando a participação dos genes responsivos a T3 e cAMP na regulação da termogênese gerada pelas vias de oxidação biológica

OBJECTIVE: We sought to identify glycolysis, glycogenolysis, lipolysis, Krebs cycle, respiratory chain, and oxidative phosphorylation enzymes simultaneously regulated by T3 and cAMP. MATERIALS AND METHODS: We performed in silico analysis of 56 promoters to search for cis-cAMP (CREB) and cis-thyroid (TRE) response elements, considering UCP1, SERCA2 and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase as reference. Only regulatory regions with prior in vitro validation were selected. RESULTS: 29/56 enzymes presented potential TREs in their regulatory sequence, and some scored over 0.80 (better predictive value 1): citrate synthase, phosphoglucose isomerase, succinate dehydrogenases A/C, UCP3, UCP2, UCP4, UCP5, phosphoglycerate mutase, glyceraldehyde 3-P dehydrogenase, glucokinase, malate dehydrogenase, acyl-CoA transferase (thiolase), cytochrome a3, and lactate dehydrogenase. Moreover, some enzymes have not yet been described in the literature as genomically regulated by T3. CONCLUSION: Our results point to other enzymes which may possibly be regulated by T3 and CREB, and speculate their joint roles in contributing to the optimal thermogenic acclimation.

OBJETIVO: Identificar enzimas das vias da glicólise, glicogenólise, lipólise, ciclo de Krebs, cadeia respiratória e fosforilação oxidativa possivelmente reguladas por T3 e cAMP. MATERIAIS E MÉTODOS: Analisamos 56 genes metabólicos in silico mediante a identificação dos elementos cis de regulação gênica responsivos ao T3 e cAMP (TREs, thyroid response elements e CREs, cAMP response elements), utilizando como referência o promotor da UCP1, SERCA2 e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase. Selecionamos somente os promotores com estudo funcional prévio in vitro. RESULTADOS: 29/56 enzimas apresentaram TREs em suas regiões regulatórias, parte com escore > 0,80 (melhor valor preditivo 1): citrato sintase, fosfoglucose isomerase, succinato desidrogenase A/C, UCP3, UCP2, UCP4, UCP5, fosfoglicerato mutase, gliceraldeído 3-P desidrogenase, glucoquinase, malato desidrogenase, acil-CoA transferase (tiolase), citocromo a3, e lactato desidrogenase; parte desconhecida como regulada por T3. CONCLUSÃO: Os resultados do presente estudo apontam para novos genes regulados por T3 e cAMP e, por conseguinte, sua contribuição na regulação da termogênese.

Aggregatibacter actinomycetemcomitansarcB influences hydrophobic properties, biofilm formation and adhesion to hydroxyapatite / arcB em Aggregatibacter actinomycetmcomitans influencia propriedades hidrofóbicas, formação de biofilme e aderência a hidroxiapatita

The regulation of gene expression in the oral pathogen Aggregatibacter actinomycetemcomitans is still not fully elucidated. ArcAB is a two-component system which allows facultative anaerobic bacteria to sense various respiratory growth conditions and adapt their gene expression accordingly. This study investigated in A. actinomycetemcomitans the role of arcB on the regulation of biofilm formation, adhesion to saliva coated hydroxyapatite (SHA) and the hydrophobic properties of the cell. These phenotypic traits were determined for an A. actinomycetemcomitansarcB deficient type and a wild type strain. Differences in hydrophobic properties were shown at early and late exponential growth phases under microaerobic incubation and at late exponential phase under anaerobiosis. The arcB mutant formed less biofilm than the wild type strain when grown under anaerobic incubation, but displayed higher biofilm formation activity under microaerobic conditions. The adherence to SHA was significantly lower in the mutant when compared with the wild type strain. These results suggest that the transmembrane sensor kinase arcB, in A. actinomycetemcomitans, senses redox growth conditions and regulates the expression of surface components of the bacterial cell related to biofilm formation and adhesion to saliva coated surfaces.

A regulação da expressão gênica do patógeno oral Aggregatibacter actinomycetemcomitans não está completamente descrita. O sistema de dois componentes ArcAB permite que bactérias anaeróbias facultativas percebam diferenças nas condições respiratórias durante sua multiplicação e adaptem a expressão de genes à estas condições. Este estudo investigou em A. actinomycetemcomitans o papel de arcB na regulação da formação de biofilme, aderência à hidroxiapatita recoberta por saliva (SHA) e nas propriedades hidrofóbicas celulares. Estas características fenotípicas foram determinadas para uma linhagem de A. actinomycetemcomitans deficiente em arcB e para uma linhagem selvagem. Foram observadas diferenças nas propriedades hidrofóbicas entre as linhagens quando estas foram cultivadas em ambiente microaerófilo até início e final de fase exponencial e quando foram cultivadas em ambiente anaeróbio até final de fase exponencial. A linhagem arcB mutante formou menos biofilme do que a linhagem selvagem quando estas foram cultivadas sob incubação anaeróbica, porém, apresentou maior formação de biofilme quando a incubação foi realizada em condições de microaerofilia. A aderência à SHA apresentada pela linhagem mutante foi significantemente menor do que a observada pela linhagem selvagem. Estes estudos sugerem que a quinase sensora arcB, em A. actinomycetemcomitans, percebe as condições redox de multiplicação e regula a expressão de componentes de superfície bacterianos relacionados à formação de biofilme e adesão a superfícies recobertas com saliva.

MicroRNAs: nova classe de reguladores gênicos envolvidos na função endócrina e câncer / MicroRNAs: novel class of gene regulators involved in endocrine function and cancer / MicroRNAs: novel class of gene regulators involved in endocrine function and cancer

MicroRNAs (miRNAs) representam uma nova classe de RNAs endógenos de ~22 nucleotídeos, que atuam como silenciadores pós-transcricionais, inibindo a tradução de RNAs mensageiros-alvo. Descobertos há pouco mais de uma década em Caenorhabditis elegans, os miRNAs são hoje reconhecidos como reguladores fundamentais da expressão gênica em plantas e animais. Até o momento, identificaram-se 462 genes de miRNA no genoma humano e estima-se que esse número supere 1000 miRNAs distintos. Análises bioinformáticas indicam que um único miRNA atue em diversos RNAs mensageiros, influenciando múltiplas vias de sinalização concomitantemente e apresentando enorme potencial regulatório. Apesar da biologia dos miRNAs ser ainda pouco entendida, essas moléculas já foram relacionadas a diversos processos biológicos. Além disso, a expressão anômala destes pequenos RNAs tem sido associada a diferentes patologias humanas, inclusive aquelas relacionadas ao sistema endócrino e câncer.

MicroRNAs (miRNAs) represent a novel class of endogenous ~22-nucleotide RNAs that negatively regulate gene expression by inhibiting translation of target RNAs. Discovered just over a decade ago in Caenorhabditis elegans, miRNAs are now recognized as one of the major regulatory gene families in plants and animals. In the human genome, 462 miRNA genes have been discovered and the estimated number of miRNAs is as high as 1000. Bioinformatics analysis indicated that a unique miRNA acts on several mRNA, influencing multiple signaling pathways concomitantly, thus presenting enormous regulatory potential. Although the biology of miRNAs is not well understood, recent evidences have linked these molecules to diverse biological processes. Moreover, aberrant expression of miRNAs has been associated to human disease, including that related to the endocrine system and cancer.

Cloning and characterization of the gene encoding the PepF endopeptidase from the aquatic bacterium Caulobacter crescentus

The metallopeptidases have a very important role in bacteria, being involved in several processes that rely on protein turnover, such as nutrition, degradation of signal peptides, protein localization and virulence. We have cloned and characterized the gene of the metalloendopeptidase PepF from the aquatic bacterium Caulobacter crescentus. The gene upstream of pepF (orf1) encodes a conserved hypothetical protein found in Mycobacterium and Streptomyces. pepF is co-transcribed with the gene downstream (orf3), which encodes a protein that belongs to the ABC1 protein kinase family, suggesting that these two proteins may share a common function in the cell. The C. crescentus PepF protein possesses the conserved HEXGH motif present in zinc binding domains of PepF homologs. Disruption of the pepF gene by insertion of a vector sequence did not produced any growth defect, but the mutant strain possesses only 30% of the specific activity of endopeptidases present in the wild type strain. Deletions and point mutations in the regulatory region showed that there are two putative promoter regions, and the operon expression is independent of the transcription regulator CtrA. The results indicate that PepF is not essential for either growth or development of this bacterium using peptides as the sole carbon source, suggesting that other peptidases can be sharing this function.

As metalopeptidases têm papel importante em bactérias, estando envolvidas em vários processos que dependem de reciclagem de proteínas, como nutrição, degradação de peptídios-sinal, localização de proteínas e virulência. Nós clonamos e caracterizamos o gene da metaloendopeptidase PepF da bactéria aquática Caulobacter crescentus. O gene a montante de pepF (orf1) codifica uma proteína hipotética conservada encontrada em Mycobacterium e Streptomyces. pepF é co-transcrito com o gene a juzante (orf3), que codifica uma proteína pertencente à família ABC1 de proteínas quinases, sugerindo que estas duas proteínas podem compartilhar uma função comum na célula. A proteína PepF de C. crescentus possui o motivo HEXGH presente nos domínios de ligação de zinco de homólogos de PepF. A interrupção do gene pepF por inserção de sequência de DNA de um vetor não gerou nenhum defeito de crescimento, mas a linhagem mutante possui apenas 30% da atividade especifica de endopeptidases presentes na linhagem selvagem. Deleções e mutações pontuais na região regulatória mostraram que há duas possíveis regiões promotoras, e a expressão do operon é independente do regulador de transcrição CtrA. Os resultados indicam que PepF não é essencial para o crescimento desta bactéria utilizando peptídios como fonte de carbono, sugerindo que outras peptidases possam estar realizando esta função.